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原創(chuàng ): niwanmao 流式中文網(wǎng) 昨天
線(xiàn)粒體是細胞代謝的重要介質(zhì),是活性氧(ROS)的產(chǎn)生者和靶點(diǎn),是ATP水平和鈣穩態(tài)的調節劑,也是參與氨基酸、脂質(zhì)和核苷酸合成的生物合成途徑的樞紐。
線(xiàn)粒體存在于所有細胞中,它們的大小、形狀和數量不同,這取決于細胞、基礎組織和其他一些因素的代謝需求??紤]到它們在細胞和機體功能中的關(guān)鍵作用,在許多遺傳和非遺傳疾病以及癌癥和衰老中觀(guān)察到線(xiàn)粒體(mt)功能障礙并不奇怪。在絕大多數情況下,mt功能障礙的顯著(zhù)特征包括mt膜電位(mtmP)、mt質(zhì)量和氧化還原電位的變化。
流式細胞儀可以快速監測完整細胞中的所有這些參數,避免mt分離和/或破膜造成的假象?,F在已經(jīng)有許多mt特異性熒光探針,可用于測量mtmP、mt質(zhì)量和mt內ROS,見(jiàn)下表:
線(xiàn)粒體膜電位檢測原理和要點(diǎn)
mtmP是質(zhì)子運動(dòng)動(dòng)力的主要組成部分,它是由mt基質(zhì)泵到膜間空間的質(zhì)子形成的。這種電位根據線(xiàn)粒體的狀態(tài)而變化,與它們合成ATP的能力有關(guān),是細胞健康的常見(jiàn)指標。mt基質(zhì)是負電位的,因此用于測量mtmP的染料通常是親脂性陽(yáng)離子化合物,即帶正電荷的分子,它們可以跨膜而不會(huì )與膜結合,并與mtmP成正比地積聚在mt基質(zhì)中。超極化線(xiàn)粒體能積聚更多的染料,而去極化線(xiàn)粒體積聚的染料較少。
通過(guò)流式細胞術(shù)評估mtmP時(shí),必須考慮兩個(gè)要點(diǎn):
首先,應仔細滴定染料濃度。高染料濃度會(huì )導致熒光猝滅,從而產(chǎn)生結果異常。雖然淬滅閾值因染料而異,但一般1–30 nM的濃度算足夠低,大多能避免不必要的淬滅現象。
其次,必須使用功能性對照來(lái)確保染料信號的變化能得到正確解讀,避免非特異性改變。合適的對照包括:
1.作為解偶聯(lián)劑的FCCP、CCCP和valinomycin,誘導去極化。2.oligomycin,一種ATP合成酶抑制劑,誘導去極化。3.nigericin,K+/H+離子載體,誘導超極化。
不同線(xiàn)粒體膜電位染料優(yōu)缺點(diǎn)
DiOC6已廣泛用于流式細胞術(shù)研究中,但是,DiOC6作為NADH抑制劑的活性,以及對mt的毒性,強烈限制了該探針的使用。
與DiOC6相似,羅丹明123(Rh123)初用于不少研究,不過(guò)Rh123雖然容易進(jìn)入細胞并迅速達到平衡,但不能很好地保留在里面。此外,在某些情況下,Rh123與線(xiàn)粒體的結合可能與線(xiàn)粒體能量狀態(tài)無(wú)關(guān),這進(jìn)一步限制了其使用。
四甲基若丹明乙酯(TMRE)和四甲基若丹明甲酯(TMRM)也被廣泛用于流式細胞術(shù)檢測mtmP,這些染料無(wú)毒,染色后不易淬滅,但應以相對較低的濃度使用,可以在染色后立即進(jìn)行分析,無(wú)需洗滌。這兩種染料激發(fā)光均為488nm,發(fā)射波長(cháng)574nm發(fā)射。通常,應準備未染色的樣品(也稱(chēng)為“空白樣品”),以設置背景熒光的水平。因此,通過(guò)TMRE或TMRM分析mtmP的變化時(shí),就被定義為給定樣品的MdFI的變化。
碳花青染料,尤其是JC-1被認為是檢測mtmP的可靠探針。JC-1具有多色熒光發(fā)射光譜,并允許對mt去極化進(jìn)行比例式半定量評估。在單體狀態(tài)下,它發(fā)出綠色熒光(529 nm),而在高度依賴(lài)于mtmP的聚集狀態(tài)下,它發(fā)出橙紅色熒光(> 590 nm),在化合物誘導mtmP崩潰時(shí),JC-1也會(huì )成為單體。這意味著(zhù),在健康細胞中,可以出現少量綠色,大多數為橙紅色熒光,線(xiàn)粒體去極化的細胞大多僅顯示綠色熒光??紤]到由于mtmP變化引起的熒光變化,顯示結果的j方法是指示mtmP高或低的細胞百分比,而不是綠色和橙紅色熒光之間的比率。
自1993年以來(lái),據報道,JC-1是幾種細胞類(lèi)型和測定條件的可靠膜電位指示劑,并且其與其他熒光探針的兼容性也已在多色方案中得到了證明。但是,JC-1對過(guò)氧化氫敏感、光敏感以及單體與聚集體形式之間的平衡速度較慢,可能會(huì )在一定程度上限制其使用。其它類(lèi)似于JC-1的還有JC-9和JC-10,JC-9的單體或聚集體形式在522 nm激發(fā),分別以535或635 nm發(fā)射。JC-10在490 nm激發(fā),并在520 nm(單體形式)或590 nm(聚集形式)發(fā)射。
線(xiàn)粒體質(zhì)量檢測染料
線(xiàn)粒體質(zhì)量可通過(guò)使用能夠結合特定mt成分的染料進(jìn)行監測,而與mt極化狀態(tài)無(wú)關(guān)。因此,熒光量與mt含量成正比。Mito ID和nonyl acridine orange(NAO)這兩種染料能與mt內膜的cardiolipin結合,而MitoTracker染料與mt蛋白中存在的半胱氨酸殘基的巰基反應。其中一些染料,包括MitoTracker deep red 633,也與mt蛋白形成共價(jià)鍵,因此在細胞染色后可以固定。與TMRE和TMRM類(lèi)似的是,對于MitoTracker染料,應測量MdFI的變化。
線(xiàn)粒體ROS檢測染料
關(guān)于mt ROS,近開(kāi)發(fā)了兩種熒光探針,分別是MitoSOX和mi,以分別標記線(xiàn)粒體中的陰離子超氧化物和過(guò)氧化氫。
MitoSOX是氫乙啶化合物,可靶向定位到線(xiàn)粒體,依賴(lài)mtmP積累到線(xiàn)粒體中,氧化后與線(xiàn)粒體DNA結合后發(fā)出熒光。與其他探針類(lèi)似,當使用MitoSOX和mi時(shí),必須準備足夠的陽(yáng)性和陰性對照全面驗證生物系統中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的j陽(yáng)性對照,而外源H2O2則是mi的正確陽(yáng)性對照。MitoSOX染色的陰性對照是細胞可滲透的超氧化物歧化酶模擬物或mt解偶聯(lián)劑,具體取決于細胞類(lèi)型。對照的其它制備形式也可以用抗氧化劑來(lái)處理,例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大減少自由基產(chǎn)生的特異性清除劑。
目前已有不少文獻通過(guò)流式細胞術(shù)對MitoSOX和mi進(jìn)行了測試,能選擇性定量角質(zhì)形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞和幾種癌細胞系中的mt陰離子超氧化物和mt過(guò)氧化氫,也有報道可能在同一細胞中同時(shí)使用MitoSOX和mi來(lái)分析活細胞中的mt ROS。
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